Geç evre mdx farelerinde Duchenne Musküler Distrofi Hastalığı için Lentiviral Mikro-distrofin Gen Tedavisi
Geliştiriciler: Selen Abanuz Eren, Cihan Taştan, Kevser Buse Karadeniz, Raife Dilek Turan, Didem Çakırsoy, Derya Dilek Kançağı, Sevdi̇can Üstün Yılmaz, Mustafa Öztatlıcı, Hülya Öztatlıcı, Samed Özer, Gamze Tümentemur, Ahmet Tarık Baykal1, ve Ercüment OvalıBu çalışma, Duchenne Musküler Distrofi (DMD) hastalığında mikro-distrofin kodlayan lentiviral gen terapisinin etkilerini 10 aylık mdx farelerinde incelemiştir. DMD, hastaların kas liflerinde distrofin eksikliğine yol açarak ilerleyici kas dejenerasyonuna neden olur. Bu çalışma, geç evre DMD farelerinde mikro-distrofin geninin lentiviral transfer yoluyla kas hücrelerine entegrasyonunu planlamıştır. Lentiviral-mikro-distrofin gen terapisi, distrofin ekspreyonunu restore etmeyi ve kas patolojisini azaltmayı amaçlamıştır. Histopatolojik ve fizyolojik-fonksiyonel yenilenme aktiviteleri, terapi yöntemlerinin karşılaştırıldığı ve distrofin ekspreyonundaki değişikliklerin incelendiği bulgulara dayanarak, tedavi sonrası motor performans analizleri (asılı kalma ve izleme testleri) istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde iyileşme göstermiştir (p <0.05). Sonuç olarak, bu çalışma, geç evre kas distrofisi hastalarının lentiviral mikro-distrofin gen terapilerinden yararlanabileceğini ve distrofik kas patolojisinde iyileşme gösterebileceğini önermektedir.
GİRİŞ
Duchenne Musküler Distrofi (DMD), dünya genelinde yaklaşık olarak 3,600 ila 9,337 erkeği etkileyen ciddi bir genetik bozukluktur [1, 2]. X kromozomuna bağlı DMD genindeki çeşitli mutasyonlar, kas liflerinin bütünlüğünü sağlayan ve işlevi kritik olan distrofin proteininin eksik veya düşük düzeyde ifade edilmesine neden olur [3, 4]. Hastalık, progresif iskelet kası dejenerasyonu, zayıflık, ambulasyon kaybı ve sıklıkla solunum komplikasyonlarından dolayı erken ölümle sonuçlanır [5]. Belirtiler genellikle 2 ila 4 yaşları arasında ortaya çıkar; etkilenen çocuklar, yaşıtlarıyla fiziksel ve bazen bilişsel olarak aynı hızda gelişmekte zorlanırlar [6].
Distrofin, costamerlerde distrofin-glikoprotein kompleksini (DGC) düzenlemek için gereklidir, bu kompleks iç hücre iskeletini dış hücre matrisine bağlar [7]. DGC, kas kasılması sırasında normal kas homeostazını sürdürmeye yardımcı olan çeşitli sinyal proteinlerinin bağlama platformu olarak hizmet eder. Distrofin eksikliği nedeniyle bu kompleksin bozulması, hücre sinyalleşmesinin bozulmasına ve kas savunma mekanizmalarının tehlikeye girmesine yol açar [8, 9]. Distrofin olmadığında, kas lifleri mekanik stres kaynaklı plazma membranındaki hasar nedeniyle kademeli olarak dejenerasyona uğrar [10].
Kaslarında distrofin üretimini geri kazandırmak için exon atlama, yerine geçen proteinlerin yukarı regülasyonu, kök hücre nakilleri gibi çeşitli stratejiler araştırılmaktadır. Distrofinin yerine yeni, genellikle kısaltılmış ancak işlevsel formda distrofinin kaslara teslim edilmesi stratejileri hedefler [11]. Lentiviral vektörler aracılığıyla gen transferi, kaslarda distrofin üretimini geri kazanmak için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. İnsan immün yetmezlik virus-1'den türetilen lentiviral (LV) vektörler, genoma entegre olabilir ve bölünen ve bölünmeyen hücrelerin geniş bir yelpazede uzun süreli transgen ifadesini sağlayabilir, bunlar arasında iskelet kası bulunur. Ayrıca, distrofinin kas kök hücrelerinde ifadesi, etkili kas iyileşmesi için gereken miyojenik progenitörlerin oluşturulmasını teşvik eder [12]. LV'nin DMD gen terapilerinde adeno-assosiyatif virüse (AAV) göre tercih edilmesinin bir diğer nedeni, terapötik bir kaset ile kök hücre havuzunun stabil transdüksiyonuna izin vermesi ve aynı anda kas kök hücrelerinin işlevselliğini iyileştirmesidir [13]. Lentiviral vektör aracılı gen transferi yöntemi, transgen ürününe karşı minimal bağışıklık yanıtı gösterir [14].
Distrofin eksikliği olan fare modelleri, distrofinin iskelet kasları, düz kaslar ve kalp dahil olmak üzere kas fonksiyonları ve nörofizyolojisi üzerindeki işlevini anlamamıza yardımcı olmuştur, özellikle yaşamının geç dönemlerinde [15-20]. DMD fareleri, 10 ay veya daha yaşlı olduklarında kas dejenerasyonu, skolyoz, solunum komplikasyonları ve kalp yetmezliği gibi ciddi distrofik fenotipler gösterirler [15-20]. Dmd-mdx-4cv farelerinin kullanımı, gen fonksiyonunun ve insan hastalıklarının patogenezinin çalışılmasına önemli katkı sağlamıştır. Ayrıca, distrofin geninde işlevsel alanların çeşitli versiyonları aracılığıyla mini-distrofin gen değiştirme terapisinin umut verici sonuçlarını gösteren birçok laboratuvar çalışması mevcuttur [21, 22].
Distrofin eksikliği olan dmd-mdx-4cv fare modeli, insan DMD hastalığı ile genetik olarak uyumludur [23]. Fare modelinin iskelet, kalp ve düz kaslarda fenotipik değişiklikleri, insan hastalığıyla karşılaştırma şansı verir. Ancak, dmd farelerin geç dönemlerinde kas dokusunun zayıflığı, kas yıkımı, kronik inflamasyon, lif nekrozu, solunum yetersizliği ve miyokard hasarı gözlenir [24]. Fibrozis 9 aydan itibaren zirveye ulaşır ve fare ömrü boyunca devam eder [25]. Önceki bir çalışmada, dmd-mdx-4cv farelerinin TA kasları, kültürdeki fibroblastlara transdüksiyon edilmiş lentiviral vektörler Lv-HSA-µDys/eGFP ile nakledilmiştir [26]. Kalp hücrelerinin iyileşmesi hakkında sonuçlar verilmemiştir. Kalp yetmezliğinden dolayı ölen hastalar da düşünüldüğünde. Bu bulgulara göre, lentiviral gen terapilerinin geç evre mdx farelerindeki etkileri hala bilinmemektedir ve bu konuda çalışmalar mevcut değildir. Ayrıca, mikro-distrofin yönetiminin mekanizmaları olgun mdx farelerinde araştırılmamıştır.
Bu çalışmada, mikro-distrofin geninde dozajın optimize edilmesinin, geç evre dmd-mdx-4cv farelerinde distrofin ifadesini artıracağı hipotezini test ettik. Ayrıca, lentiviral terapinin düşük ve yüksek dozlarının distrofin ifadesine yol açabileceğini gösterdik. Ayrıca intramusküler ve intraperitoneal enjeksiyon yollarının, dmd-mdx-4cv farelerinde iskelet ve kalp kaslarında distrofin ifadesini sürdürebileceğini gösterdik. Bu bulgular, terapötik gen terapisi için klinikte LV'nin transferinde önemlidir.
2. MATERYAL VE YÖNTEMLER
2.1. Lv-HSA-μDys/eGFP Yapısının Sentezi ve Lentivirüs (LV) Üretimi
Lentiviral vektör Lv-HSA-μDys/eGFP (Addgene plazmid #26810; Jeffrey Chamberlain tarafından hediye edilmiştir) Addgene'den temin edilmiştir [26]. Envelop pCMV-VSV-G plazmidi (Addgene #8454; Bob Weinberg tarafından hediye edilmiştir) ve paketleme plazmidi psPAX2 (Addgene #12260; Didier Trono tarafından hediye edilmiştir) Addgene'den satın alınmıştır. Bu üç plazmidin DNA dönüşümleri E.coli DH5α bakterilerine (NEB® 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)) yapılmıştır. Plazid izolasyonu için QIAfilter Plazmid Giga Kiti kullanılmış ve kitin talimatları takip edilmiştir. Elde edilen plazmidlerin miktarı ve saflığı Nanodrop ile ölçülmüş, DNA saflık analizi jel elektroforezi yöntemiyle yapılmıştır. HEK293T hücreleri ev sahibi hücre olarak kullanılmış ve DMEM ortamında (%10 Fetal Bovin Serum, %1 Penisilin/Streptomisin) kültürlenmiştir. Transfeksiyondan önce, invert mikroskop altında hücrelerin %80 konflansiyonu kontrol edilmiştir. İzole edilen psPAX2, pCMV-VSV-G ve µDYS plazmidleri (1:1:2 oranında) FuGENE HD (Promega) transfe reaktifi ile serum içermeyen OptiMEM ortamında (Thermo Fisher Scientific) lentivirüs üretimi için karıştırılmıştır. Transfeksiyondan 72 saat sonra, hücre kültürlerinin süpernatantlarından paketlenmiş rekombinant Lv-HSA-μDys/eGFP lentivirüsü toplanmıştır. Daha sonra süpernatantlar 3000 rpm'de 10 dakika santrifüj edilmiş, süpernatantlar Stericup hızlı salınan durapore 0.45 μm (Millipore) ile filtrelenmiş ve Lenti-X konsantratörü (Takara Bio) ile konsantre edilmiştir [28].
2.2. Lv-HSA-μDys/eGFP'in Transfeksiyon Ünitelerinin (TU/mL) Hesaplanması ve Kalite Kontrol Testleri
QuickTiter™ Lentivirus Titer Kiti (Lentivirus İlişkili HIV p24 Elisa) kullanılarak transfeksiyon birimi (TU) hesaplanmıştır. Kiti talimatları takip edilmiştir. Lv-HSA-μDys/eGFP titer testinin ardından, sterilite, saflık ve replikasyon-kompetan lentivirüs (RCL) analizleri de dahil olmak üzere diğer kalite kontrol testleri yapılmıştır. Üretilen plazmid ve lentivirüsün tüm kalite kontrol testleri, akredite protokollerle Acıbadem Labmed Laboratuvarı'nda gerçekleştirilmiştir. Kalite kontrol testleri (Tablo 1) tabloda sunulan yöntemlere dayanarak ve kabul kriterlerine göre yapılmıştır [29]. Sterilite, BACTEC™ FX kan kültürleme cihazı ile BACTEC kan kültür şişelerinde test edilmiştir. Mycoplasma analizi, Mycoplasma species 500 PCR kiti ve GeneAmp PCR Sistemi 2700 (Applied Biosystems) ile belirlenmiştir. RCL testi, mesenkimal kök hücre (MSC) ile yapılan 3 haftalık inkübasyon periyodu temelinde gerçekleştirilmiştir [30]. MSC hücrelerine eklenen süpernatantlar daha sonra transdükte edilmemiş taze MSC hücreleri ile yeniden inkübe edilmiş ve eGFP ifadesi akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Bu deneyin kabul kriteri, ≤1% eGFP ifadesinin tespit edilmesiydi [28]. Lentiviral entegrasyonunun kontrol edilmesi için insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) hücre kültüründe DMEM yüksek glukozlu ortam (%10 Fetal Bovin Serum, %1 Penisilin/Streptomisin) kullanılmıştır. Jurkat hücre kültürü için RPMI1640 ortamına (%10 Fetal Bovin Serum, %1 Penisilin/Streptomisin, %1 Mem Vitamin, %1 Mem Non-essential aa ve %1 Sodyum Piruvat) eklenmiştir. 10.000 Jurkat ve PBMC hücresi, 100 µl ortamda çift olarak ve her biri 96-pozisyonlu bir plakada tek olarak ekilmiştir. 10 µl lentivirüs eklenmiştir. Kontrol hücre grubuna virüs eklenmemiştir. Plak 37°C'de üç gün boyunca inkübe edilmiştir. Üç gün sonra, kuyruklar akış sitometrisinde okunmuştur.
2.3. Lv-HSA-μDys/eGFP'in Dmd-mdx-4Cv Farelerine Enjeksiyonu
Acibadem Mehmet Ali Aydinlar Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Uygulama ve Araştırma Merkezi'nden (ACUDEHAM; İstanbul, Türkiye) AAALAC International akredite edilmiş beş dmd-mdx-4Cv ve beş C57BI/6 (kontrol) yabanıl tip (WT) fare kullanıldı. Tüm hayvan çalışmaları, Acibadem Mehmet Ali Aydinlar Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi (ACU-HADYEK) tarafından etik onay almıştır. Dmd-mdx-4Cv fareler rasgele olarak üç gruba ayrıldı: tedavi edilmemiş dmd-mdx-4cv grup (n = 4) ve iki farklı doz grubu (tedavi grupları) (0.5x10^6 TU/300 µl ve 1.5x10^6 TU/300 µl, her grup için n = 5). Dose 1 grubu için fare başına 0.5x10^6 TU/300 µl, Dose 2 grubu için ise fare başına 1.5x10^6 TU/300 µl hazırlandı. Sol ve sağ tibialis anterior (TA) kısımlarına her birine 100 µl olacak şekilde enjekte edildi. 0.5x10^6 TU/300 µl fare başına Dose 1 grubu, Dose 2 grubu için 1.5x10^6 TU/300 µl fare başına ayarlandı. Farelerin 0. ve 15. günlerinde uygun doz gruplarına intramusküler (IM) ve intraperitoneal (IP) yollarla enjekte edilmiştir. IM enjeksiyonları farelerin arka bacaklarının sol ve sağ tibialis anterior (TA) bölümlerine uygulanmıştır. Tedavi öncesinde 12. ve 2. saatlerde ve tedavi sonrasında 4. saatte 5 mg/kg deksametazon IP yoluyla doz gruplarına ve pozitif kontrol gruplarına enjekte edilmiştir [31] (Şekil 1). Hayatta kalma ve vücut ağırlığı değişiklikleri iki haftada bir kontrol edilmiş ve kaydedilmiştir.
2.4. Motor Performans Analizi
Kas görünümündeki histolojik iyileşmeler değerlendirilebilir olsa da, ön klinik çalışmamız insan klinik çalışmasına geçmeden önce fizyolojik ve fonksiyonel iyileşmeleri tespit etmeyi amaçlamaktadır. Bu nedenle, Dmd-mdx-4Cv farelerinde kas fonksiyonunu değerlendirmek için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Testler bağımsız olarak üç kez tekrarlanmıştır.
2.4.1. Asma Testi
Bu test, SOP #DMD_M.2.1.004'e göre tasarlanmıştır. Gen transferi sonrası DMD model farelerinde denge, koordinasyon ve kas durumu asma testleriyle değerlendirilmiştir. Test için önce askı aparatı kurulmuştur. Aparat kurulumu için yaklaşık olarak 37 cm mesafede sabitlenmiş 2 mm kalınlığında metal bir askı rafına sıkıca tutturulmuştur [32]. Fare daha sonra ızgaraya yerleştirilmiş ve dört pençesiyle sıkıca kavranmıştır. Süreç başlatıldığında fare dört pençesiyle (ön ve arka pençe) asılı durumda tutulmuştur. Fare telin üzerinden düştüğünde süre durdurulmuş ve maksimum asılı kalma süresi kaydedilmiştir. Test bağımsız olarak üç kez tekrarlanmıştır.
2.4.2. Rotarod Koşu Testi
Fareler sabit hızda 5 rpm olarak ayarlanmış bir tüpte döndürülmüş, başlangıçtan itibaren ilk 15 saniyede hız 5 ila 45 rpm arasında artırılmıştır. Sonrasında hız sabitlenmiştir. Fareler, rotarod tüpü yavaş sabit hızda 5 rpm dönüyorken tüpe yerleştirilmiştir. Fareler yerleştirildikten sonra koşuya başlamıştır. Fareler koşu esnasında gözlemlenmiştir. Çalışma süresi sürekli olarak kaydedilmiştir. Fare düştüğünde zaman otomatik olarak durdurulmuştur. Maksimum koşu süresi 500 saniye olan farelerin test seansı sona ermiştir. Test bağımsız olarak üç kez tekrarlanmıştır.
Tablo 1. Lv-HSA-μDys/eGFP Lentivirüs Üretim Kalite Kontrol Analizi
Kısaltmalar: PCR: polimeraz zincir reaksiyonu, RCL: replikasyon yetenekli lentivirus, PBMC: periferik kan mononükleer hücreler. Bu tablo, Lv-HSA-μDys/eGFP lentivirüs üretimi sırasında yapılan çeşitli kalite kontrol testlerinin sonuçlarını özetlemektedir. Her parametre belirlenmiş kabul kriterlerine göre değerlendirilmiş ve lentiviral vektörün kalitesi ve güvenliği deneyler için sağlanmıştır.
Şekil (1). Deneysel plan, zaman, enjeksiyon ve enjeksiyon yolu. Dose 1 (n=5) ve Dose 2 (n=5) grubunun Deksametazon ve Lv-HSA-μDys/eGFP enjeksiyonu alması ve kontrol grubunun (n=5) sadece Deksametazon uygulamasını takiben. (BioRender.com ile oluşturulmuştur) (Bu figürün yüksek çözünürlüklü / renkli versiyonu makalenin elektronik kopyasında mevcuttur)
2.4.3. Ayak İzi Testi
Farelerin sol ve sağ ayakları farklı renklerle (mor/yeşil) boyandı ve kağıt üzerinde yürütüldü, 47 cmlik yürüme mesafesi temel alındı. İki adım arasındaki mesafe bir cetvelle ölçüldü ve cm cinsinden kaydedildi [33]. Test bağımsız olarak üç kez tekrarlandı.
2.4.4. Takip Testi
Fareler genellikle açık alan etkinliğinde takip tabanlı testlerle test edildi. 80 cm x 80 cm boyutlarında ve 40 cm yüksekliğinde bir kutunun üstüne monte edilmiş kamera ile sessiz bir odada Ethovision XT9 programı ile 6 dakika boyunca kaydedildi [34]. Her fare bireysel olarak kaydedildi. Hız (cm/s), kümülatif süre ve dönme (frekans) sonuçları karşılaştırıldı. Test bağımsız olarak üç kez tekrarlandı.
2.5. Kan Analizi
Kas hasarını değerlendirmek için serumdaki kreatin kinaz (CK) seviyeleri ölçüldü. Fare kanı, 800 x g'de 25 dakika boyunca santrifüj yapılarak serum elde edildi. Tüm farelerin CK seviyelerini ölçmek için VETLAB Anadolu Laboratuvarı'nda onaylı yöntemler kullanıldı.
2.6. Kantitatif Ters Transkriptaz PCR
Distrofin gen ekspresyonunu ölçmek için, iskelet kası ve kalp dokularından RNA izolasyonu (Zymo Research Direct-zolTM RNA Miniprep Plus kiti ile) yapıldı. İlk olarak, kas ve kalp dokuları homojenizatör (GentleMACSTM Dissociator, Miltenyi Biotec) ve C-tüpleri (Miltenyi Biotec) kullanılarak liz edildi, sonra kit protokolü takip edilerek RNA izolasyonu devam etti. RNA'dan cDNA (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) elde edildikten sonra, tasarlanmış distrofin primerleri (5′→3′); mikro-distrofin: aacaaagtgccctacta (ileri), ve aggttgtgctggtcca (ters) ve ribozomal RNA 18S: ttgacggaagggcaccag (ileri) ve gcaccaccacccacggaatcg (ters) (Sentromer) ve SYBR Green Master PCR reaksiyonu (Applied Biosystems) kullanıldı [35]. Cq değerleri Applied Biosystems cihazı ile elde edildi ve StepOne™ ve StepOnePlus™ Yazılımı v2.3 kullanılarak 2-ΔΔCt yöntemine göre analiz edildi. Her örnek çift olarak çalıştırıldı. Distrofin ekspresyonları gruplar arasında karşılaştırıldı.
2.7. İmmünohistokimya
İskelet kası ve kalp dokuları hemen PBS içinde kesildi. İskelet kasları transvers olarak, kalp kasları ise longitudinal olarak kesilmelidir. Her iki doku da cryomatrix (Thermo) jelinde gömüldü. Kalp ve iskelet kası dokularından 5 μm kalınlığında kesitler Cryostat cihazında (CM1900, Leica) alındı. Kesitler -20 °C'de immünohistokimyasal boyama yapılana kadar saklandı. Daha sonra, primer antikor boyaması için anti-distrofin (NCL-DYS1, Leica) eklenerek +4 °C'de 1 gece bekletildi. Ticari kit ile birlikte gelen biyotin içeren ikincil antikor (TP-060-BN, Thermo Scientific) ile 30 dakika oda sıcaklığında işlem gördü ve ardından PBS ile 3 kez 5 dakika yıkandı. İmmünreaktivitenin görünürlüğünü sağlamak için Diaminobenzidin (DAB) boyası (TA-125-HD, Thermo Scientific) ile 5 dakika boyunca boyama yapıldı. Görüntüler kamera entegre ışık mikroskobu (Olympus DP26-CU; Leica MD 750) ile elde edildi. İmmünohistokimya boyamasındaki yoğunluklar, Image J (Yazılım, sürüm 2.0.0-Beta4) kullanılarak her grup için rastgele seçilen on farklı alan üzerinden değerlendirildi. Kahverengi renkli hücrelerin görünümü ile DAB pozitif boyama gözlemlendi. Elde edilen Optik Yoğunluk (OD) değerleri istatistiksel analiz ile karşılaştırıldı.
2.8. Histopatolojik Uygulamalar
Fareler postimmünizasyon sonrası histopatoloji analizi için kurban edildi. Dalağın ve karaciğerin rutin doku işlemesinden önce 10% tamponlu formalin çözeltisine alındı. Dokular rutin doku işleme işleminden sonra parafin bloğunda bloke edildi. Bu bloklar 5 µm kalınlığında mikrotom ile kesildi, hematoksilen-eozin (H&E) ile boyandı ve bir ışık mikroskobu (Zeiss) ile incelendi.
2.9. İstatistiksel Analiz
Bar grafiklerinde normal dağılım gösteren veriler, iki bağımsız ortalamalar için Student's t-testi kullanılarak test edildi. Normal dağılmayan veriler için iki grup arasında karşılaştırma yapmak için Mann-Whitney U testi kullanıldı. Tedavi öncesi ve sonrası karşılaştırma için eşleştirilmiş t-testi kullanıldı. İstatistiksel analizler GraphPad Prism 9 ve SPSS Statistics yazılımları kullanılarak yapıldı. Her veri bağımsız bir ölçümü temsil etmektedir. Bar grafikleri ortalama ve ortalama standart sapmayı rapor eder. Tüm testler için anlamlılık eşiği * p <0.05, **** p <0.0001 olarak belirlendi ve ns anlamsız sonuçları ifade eder.
3. SONUÇLAR
Önceki çalışmalar, mdx farelerinde dokupatolojisinin dokuz ay içinde önemli fibrozis ile ilerlediğini göstermiştir. Biz de 10 aylık mdx farelerinde DMD patolojisinin ilerlemesini izlemek için performans testleri kullanarak dört grup üzerinde lentiviral mikro-distrofin tedavileri kurduk. On ay süreyle, vahşi tip kontrol, doz 1, doz 2 ve tedavi edilmemiş dmd-mdx-4cv fare grupları, gen terapimizin enjeksiyonundan önce ve sonra kas fonksiyonunu değerlendirmek için çeşitli tekniklerle incelendi. Doz grupları arasındaki tek fark, doz 2 (1.5x106 TU) grubunda farelerin doz 1 (0.5x106 TU) grubuna göre üç kat daha fazla TU ile enjekte edilmiş olmasıdır. Tedavi edilmemiş dmd-mdx-4cv farelere enjeksiyon sırasında yalnızca PBS verildi. Deneysel enjeksiyon zaman dilimi Şekil (1)'de gösterilmiştir. Uluslararası literatürde kabul görmüş kalite kontrol testlerinin listesi, sonuçların kabul kriterlerini takip ettiğini göstermektedir. Kalite kontrol testleri Tablo 1'de gösterilmiştir.
3.1. Motor Performans Analizi
Motor performans testlerinin amacı, TA bölgesine enjekte edilen mikro-distrofinin etkisini ölçmek değildir. Performans testini değerlendirmeden önce, her iki arka ekstremiteye TA bölgesine enjeksiyon yapılmış, kas kuvvetini artırmayı amaçlayan bir işlem uygulanmıştır. Gen terapisi tedavisinin iki dozundan sonra, doz grupları fareleri asılı testinde dmd-mdx-4cv farelerinden daha iyi performans göstermiştir. Doz gruplarının karşılaştırılmasında, doz 1 grubu farelerinin daha uzun süre tutunabildiği gözlenmiştir. Tedavi edilmemiş grup fareleri ise kontrol grupları kadar fazla asılı kalamamıştır (Şekil 2A). Rotarod testi sırasında, doz 1 grubu diğer gruplardan daha uzun süre koşmuş olsa da, anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 2B). Ayak izi testinden sonra, iki adım arasındaki mesafe ölçülmüş ve herhangi bir fark gözlenmemiştir (Şekil 2C). Bir izleme testi, hız, gerçek mesafe, hareket ve hareketsiz faktörleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Tedavi sonrasında, doz 2 grubu tedavi edilmemiş gruba göre önemli ölçüde daha hızlı olmuştur. Doz 1 grubunda ise doz 2 grubuna kıyasla bir artış gözlenmemiştir (Şekil 2D). Doz 1 grubu, dmd-mdx-4cv'ye göre daha yüksek mesafe hareketine ulaşmıştır (Şekil 2E). Doz 2 grubu kontrolle aynı hızda hareket etmiştir (Şekil 2F). Tedavi edilmemiş dmd-mdx-4cv farelerinde zaman açısından belirgin şekilde daha az hareket gözlenmiştir (Şekil 2G). Kontrol ve tedavi edilmemiş gruplar arasındaki farklar, tüm motor fonksiyon testleri sırasında belirgin şekilde ortaya çıkmıştır. Tedavi edilen gruplar, tedavi edilmemiş dmd farelerine göre asılı ve izleme testlerinde belirgin şekilde daha iyidir. Bu sonuçlar, her iki lentiviral doz tedavi grubunun dmd modeli mdx farelerinin motor fonksiyonlarında istatistiksel olarak anlamlı bir iyileşme gösterdiğini göstermektedir.
3.2. Tedavi Sonrası Kan Analizi
Tüm DMD hastalarının doğumdan itibaren ciddi şekilde yüksek serum CK seviyeleri vardır [36]. Bu nedenle, kas yıkımının en önemli belirteci olan CK'nin serumda analiz edilmesi gerekmektedir. Serum toplanarak CK seviyeleri analiz edilmiştir. Tedavi edilmemiş dmd-mdx-4cv farelerinin serum CK seviyesi yaklaşık olarak 1500 U/L (n=4) olarak belirlenmiştir. Ancak Lv-HSA-μDys/eGFP gen terapisi uygulanan farelerde, hem doz 1 hem de doz 2 gruplarındaki CK seviyelerinin tedavi edilmemiş gruba kıyasla daha düşük olduğu gözlenmiştir (Şekil 3). Bu sonuçlar, her iki tedavi grubundaki farelerde CK seviyelerinin, tedavi edilmemiş DMD kontrol farelerine benzer şekilde önemli ölçüde düştüğünü göstermektedir.
3.3. Q-RT-PCR ve İmmünohistokimya ile Distrofin İfadelerinin İncelenmesi
Sonraki adımda, tedavilerden sonra dissected doku örneklerinde distrofin ifadelerini belirlemeyi amaçladık. Tüm farelerden iki boyutlu kesitler alındı ve bu kesitlerde mikro-distrofin ve protein ifadelerinin incelenmesi hedeflendi. Q-RT-PCR sonuçlarına göre, Lv-HSA-μDys/eGFP gruplarında hem iskelet hem de kalp kaslarında mikro-distrofin mRNA seviyeleri, tedavi edilmemiş DMD kontrol grubuna kıyasla artmıştı. Tedavi sonrasında, iskelet ve kalp kaslarında distrofin ifadesi tespit edilirken, tedavi edilmemiş grupta herhangi bir mRNA ifadesi tespit edilmedi (Şekiller 4A ve B). Doz 1 ve 2 grupları iskelet kaslarında kontrol ve birbirlerinden önemli ölçüde farklıydı (Şekil 4A). Daha düşük doz uygulamasından sonra iskelet kas hücrelerinde yaklaşık %10 distrofin ifadesi gözlemlendi. Ancak, daha yüksek doz enjekte edildiğinde bu ifade yaklaşık %20'ye ulaştı. Lv-HSA-μDys/eGFP, kalp dokusunda distrofin ifadesi düzeylerini doz gruplarında pek farklı olmadan azalttı (Şekil 4B). Tedavi edilmemiş grupta distrofin ifadesi tespit edilmedi, bu da gösteriyor ki 10 aylık mdx farelerinin iskelet ve kalp kas hücrelerinde önemli μDys ifadesi elde edilmişti.
İnsan µ-distrofin geninin TA iskelet ve kalp kaslarında etkin bir şekilde ifade edildiği Figür (5A) gösterilmiştir. Enjeksiyondan sonraki 4 hafta içinde TA kaslarının immünohistokimya analizi, Lv-HSA-μDys/eGFP ile tedavinin distrofin ifadesini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir (Figür 5B). Yüksek doz uygulaması iskelet kaslarında daha yüksek distrofin ifadesine yol açtı. Ancak, kalp dokusunda doz 1 ve 2 grupları arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (Figür 5C). Tüm gruplar için iskelet ve kalp dokularında distrofin ifadesi yaklaşık olarak benzerdi. İskelet ve kalp kası kesitlerinde, tedavi edilmemiş DMD farelerinde distrofin ifadesi kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmıştı. Öte yandan, HSA promotörünün, müsküler olmayan hücrelerde μDys/eGFP ifadesine olanak tanıyan sızıntılarını belirlemek istedik. Bunun test edilmesi için, μDys/eGFP'nin HSA promotörü altında kodlayan lentivirüs ile transdüksiyon sonrası insan Jurkat hücre hattında ve sağlıklı insan bağışçılardan izole edilen primer periferik mononükleer hücrelerde μDys/eGFP ifadesini değerlendirdik (Figür S1). Veriler, HSA promotörünün iskelet kası ve kalp kası hücreleri de dahil olmak üzere müsküler hücrelerde μDys/eGFP ifadesine izin verdiğini önemli ölçüde göstermektedir. Bu nedenle, sadece müsküler hücrelerde μDys ifadesini belirlemeyi amaçladık.
Tablo (2). Mikro-distropin kodlayan lentivirüsün uygulamasından sonra motor performans analizi. (A) Asılı kalma testi, (B) Rotarod testi, (C) Ayak izi testi, (D) Hız izleme testi, (E) Kat edilen mesafe izleme testi, (F) Hareket izleme testi, (G) Hareketsizlik izleme testi. Ethovision XT9 programı kullanıldı. Test bağımsız olarak üç kez tekrarlandı. Sonuçlar, ortalamalar ± standart sapma olarak gösterildi. *p <0.05.
(Elektronik kopyadaki daha yüksek çözünürlüklü/renkli versiyonu bu figürün mevcut olabilir.)
Figür (3). 10 aylık farelerde serum kreatin kinaz (CK) düzeyi.
CK düzeylerinin azalmasını gösteren çubuk grafiği. Sonuçlar, ortalamalar ± standart sapma olarak gösterildi. *p <0.05.
(Elektronik kopyadaki daha yüksek çözünürlüklü/renkli versiyonu bu figürün mevcut olabilir.)
3.4. Karaciğer ve Dalak Fizyolojik ve Histopatolojik İncelemeleri
Mikro-distropin kodlayan lentivirüs tedavisinden bir gün öncesinden itibaren vücut ağırlığı değişiklikleri her iki haftada bir kontrol edildi. Grupların vücut ağırlıkları karşılaştırıldığında anlamlı bir değişiklik tespit edilmedi (Şekil 6A). Ayrıca, tedavi öncesi ve sonrasında bireysel gruplarda anlamlı bir ağırlık değişikliği gözlenmedi (Şekil 6B).
Karaciğer ve dalak dokusu ile histopatolojik değerlendirmeler yapıldı. Hayvanlar kurban edildikten sonra organlar tartıldı ve karaciğer ve dalakta kontrol, tedavi edilmemiş ve doz grupları arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 7A ve B). H&E boyaması sonrası, kontrol gruplarında karaciğer parankim yapısında genellikle normal hepatositlerden oluşan normal bir yapı gözlendi (ok işareti). Merkezi ven (cv) etrafında radyan plaklar şeklinde hepatositler düzenli olarak yer aldı. Portal alan, periportal alan, hepatositler ve sinusoidler doz 1 grubunda kontrol grubuna benzer bir yapıda farklılaştı. Dmd-mdx-4cv farelerinin ve doz 2 gruplarının sitoplazmasında difüz vakuol içeriğine sahip hepatositler (ok işareti), sinusoidal dilatasyon ve interstisyel kanama (yıldız işareti) saptandı. Doz 1 grubunun dalak kesitlerinde kontrol grubuna benzer şekilde beyaz pulpa (bp), kırmızı pulpa (rp), merkezi arter (ca) ve trabeküla (t) ayırt edildi. Trabeküler bağ dokusu, özellikle damarlar etrafında (ok işareti), tedavi edilmemiş ve doz 2 gruplarında daha belirgin bir şekilde görüldü (Şekil 7C). Her dozda eski farelere lentiviral mikro-distropin gen tedavisi uygulamak bile toksik olarak değerlendirilmedi.
4. TARTIŞMA
DMD ölümcül genetik bir nöromusküler bozukluktur ve şu anda DMD için bir tedavi bulunmamaktadır [37]. Gen terapisi günümüzde potansiyel bir tedavi olarak kabul edilmektedir. DMD gen terapisi sonuçları, kas hücrelerinde distrofin ifadesinin geri kazanılması için önemli ölçüde yüksek yanıt oranları göstermiştir [12, 13]. Burada sunulan çalışma, geç dönem dmd-mdx-4cv farelerinde farklı dozların ve iki enjeksiyon yönteminin (kas içi ve intraperitoneal) test edildiğini göstermektedir. Lentiviral mikro-distropin başarıyla TA iskelet kaslarının sağ ve sol taraflarına kas içi enjeksiyon yoluyla ve IP enjeksiyonu ile aktarılmıştır. TA bölgesi, ilaçların test edildiği enjeksiyon denemelerinde tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi için güçlü bir şekilde savunulmaktadır [38]. Bu gen tedavisinin etkinliğini histolojik, fonksiyonel ve fiziksel gözlemlerle doğruladık.
Tablo (4). İskelet ve kalp kaslarında distrofin ifadesi. (A) İskelet kası göreceli mRNA ifadesi. (B) Kalp kası göreceli mRNA ifadesi. Sonuçlar, ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. ****p <0.0001. (Makalenin elektronik kopyasında daha yüksek çözünürlüklü / renkli versiyonu bulunmaktadır).
Tablo. (7). Kontrol, doz grubu ve tedavi edilmemiş DMD fare grubunun karaciğer ve dalak histopatolojik incelemesi. (A) Karaciğer organlarının tartım sonuçlarını gösteren çubuk grafikleri. (B) Dalak organlarının tartım sonuçlarını gösteren çubuk grafikleri. Sonuçlar, ortalamalar ± SD olarak gösterilmiştir. (C) Fare gruplarının histopatolojik analizi. Dalak ve karaciğer parafilm kesitleri H&E ile boyanmıştır. Tüm resimler 100x büyütme ile gösterilmektedir. bp: beyaz pulpa, cv: santral ven, ca: santral arter, rp: kırmızı pulpa, t: trabekül, yıldız: interstisyel kanama, ok: hepatosit. (Makalenin elektronik kopyasında daha yüksek çözünürlüklü / renkli bir versiyonu mevcuttur).
Viral gen transferi, klinik uygulamalarda kullanılan viral vektörlerin paketleme kısıtlamaları tarafından engellenmektedir. Bu vektörler, distrofin geni gibi büyük transgenler ile çalıştıklarında verimliliklerini azaltmaktadır [13]. Ancak mikro-distrofin lentiviral vektörlerinin kullanımı bile yüksek düzeyde distrofin ekspresyonuna yol açmıştır. Distrofin ile ilgili mRNA ekspresyonu sonuçlarının yanı sıra, immünohistokimya görüntüleri, uygulanan dozlarda açık bir fark ve iyileşmeyi göstermektedir. Yüksek doz grubu (1.5x10^6 TU çift doz verilerek) asılı durma ve hareket parametrelerinde gösterilen iskelet kaslarının motor fonksiyonunun önemli ölçüde arttığını göstermiştir, takip testinde. Asılı durma testinde zaman, farelerin dört ayakları (arka ve ön ayak) ile asılı durduklarında başlatıldı. Dolayısıyla farelerin dört pençesi ile tel üzerine tutunmaları gerekiyordu. Her iki doz grubunda da lentiviral gen tedavileri IM ve IP yoluyla uygulandı. İM uygulamasıyla kaslar üzerindeki etkisini değerlendirirken, IP uygulamasının tüm sistem üzerinde etkili olmasını bekledik.
Gen terapide AAV'nin yaygın olarak kullanılmasına rağmen, distrofin geninin büyüklüğü nedeniyle LV tedavisini tercih ettik. Ayrıca, LV'nin uygulamasından sonra bağışıklığın azalması sağlanmaktadır. DMD için AAV gen terapisi hala gelişme aşamasındadır ve geliştirilmesi gerekmektedir. Diğer yandan, literatürde kullanılan kreatin kinaz promotörü (dMCK) kalpte etkili değildir [39]. Bu nedenle, insan iskelet aktin promotörü (HSA) tercih ettik ve IP enjeksiyonunun yardımıyla kardiyak hücrelerde distrofin ekspresyonunu indükledik.
Kreatin kinaz (CK), DMD hastalarının ve distrofik fare modellerinin serumunda yüksek düzeyde yükselir. Bu çalışmalarda, mikro-distrofin transgen tedavisi, LV enjeksiyonundan sonra CK seviyelerini normalleştirme yeteneğine sahipti ve sonuçta tedavi edilmemiş DMD farelerine göre kan seviyelerini korudu. Bu, lentiviral mikro-distrofin gen tedavi yöntemimizin iyileşmeyi ve yüksek etkinliğini doğrular. Terapötik etkinliği daha da artırmak için yüksek doz uygulaması tercih edilmelidir, çünkü bu kas fonksiyonunu ve stabil distrofin ekspresyonunu iyileştirmektedir.
Erken dönem DMD-mdx-4cv farelerinde fizyolojik DMD profilleri, utrofin ekspresyonu nedeniyle zordur [40]. Ancak, 10 ay veya daha yaşlı farelerde, fizyolojik ve fonksiyonel kas bozulması kolayca tespit edilebilir. Sonuçlarımız, motor performans testlerinin uygulanmasından sonra iskelet kaslarında iyileşme gösterdiğimizi göstermektedir. Anlamlılık belirlenmemiş olsa da, doz 1 ve tedavi edilmemiş DMD gruplarının farelerinin ağırlığı kas dejenerasyonu ve farelerin yaşlanması nedeniyle bir ay içinde azalmıştır. Ancak, doz 2 gruplarının ağırlık değişikliği önemsizdi ve kas distrofin iyileşmesi nedeniyle ağırlıkları artmıştır. Karaciğer ve dalakta herhangi bir toksisite gözlemlenmemiştir, ancak ileri yaşta çift doz uygulamış olmamıza rağmen. AAV'nin boyutu lentiviralden daha küçüktür, bu nedenle başlıca olarak AAV vektörlerinin kan-beyin bariyerini geçememe sorunu vardır (BBB). BBB'nin tıkanması nedeniyle, vasküler düz kas hücreleri de dahil olmak üzere birçok dokuda distrofin ekspresyonu geri kazanılır, ancak beyin dokularında (BBB) değil [41, 42]. Bu nedenle, testimiz santral sinir sistemi (CNS) lentiviral entegrasyonuna odaklanmamıştır. Bunun yerine, iskelet ve kardiyak kaslarda distrofin ekspresyonunu geri kazanmayı amaçlıyoruz. Vektörümüzde, iskelet kas spesifik bir promotör/iyileştirici element olarak HSA promotörünü tercih ediyoruz ve bu nedenle karaciğer, dalak, böbrek veya CNS'de herhangi bir lentiviral vektör entegrasyonu beklenmemektedir. Diğer yandan, Lv-HSA-μDys/eGFP'nin uzun vadeli etkisi, kas fonksiyonunu ve distrofin ekspresyonunu koruma açısından DMD fare modelinde belirlenmemiştir.
SONUÇ
Geç dönem dmd-mdx-4cv fare modelinde, insan mikro-distrofin geninin çift doz terapötik etkileri, patolojiyi başarıyla iyileştirmekle kalmayıp iskelet ve kardiyak distrofik kasların işlevselliğini de geliştirmiştir. Sonuçlar ayrıca bu özel mikro-distrofin gen varyantının klinik çalışmalarda lentiviral terapi için potansiyel kullanımını işaret etmektedir.
YAZAR KATKILARI
SAE, CT, RDT, DC ve DDK deneyleri tasarladı, tamamladı ve/veya analiz etti. MO ve HO immünohistokimya ve q-RT-PCR analizlerini gerçekleştirdi. SAE, KBK, SUY ve SO hayvan tedavilerini ve motor performans testlerini yaptı. GT dokuların histopatolojik analizini yaptı. SAE ve CT makaleyi yazdı. ATB ve EO geliştirme projesini yönetti, tasarıma katkı sağladı ve projeyi denetledi.
KISALTMALAR LİSTESİ
- AAV = Adeno-Associated Virus
- CK = Kreatin Kinaz
- DAB = Diaminobenzidin
- DGC = Distrofin-Glikoprotein Kompleksi
- DMD = Duchenne Musküler Distrofi
- IM = İntramusküler
- IP = İntraperitoneal
- LV = Lentiviral
- OD = Optik Yoğunluk
- PBMC = Periferik Kan Mononükleer Hücreleri
- RCL = Replikasyon Yeteneğine Sahip Lentivirus
- TA = Tibialis Anterior
- TU = Transfeksiyon Ünitesi
- WT = Yaban Tipi
ETİK ONAY VE KATILIM İZNİ
Tüm hayvan deneyleri Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Deney Hayvanları Komitesi tarafından onaylanmıştır (ACUHADYEK 2018/50). İnsan periferik kan mononükleer hücre toplama işlemi Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (ACUATADEK 2022-12).
İNSAN VE HAYVAN HAKLARI
Bu araştırmanın temeli olan çalışmalarda insanlar kullanılmamıştır. Tüm hayvanlar, ABD Ulusal Araştırma Konseyi'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanımı Rehberi", ABD Halk Sağlığı Servisi'nin "Laboratuvar Hayvanlarının İnsancıl Bakım ve Kullanımı Politikası" ve "Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanımı Rehberi"ne uygun olarak kullanılmıştır.
YAYIN İZNİ
Yayın için onay gerekmemektedir.
VERİ VE MATERYALLERİN ERİŞİLEBİLİRLİĞİ
Bu araştırmanın bulgularını destekleyen verilerin makale içinde mevcut olduğunu doğruluyoruz.
FİNANSMAN
Bu çalışma Acıbadem Sağlık Grubu tarafından finanse edilmiştir.
ÇİKİNÇ ÇIKAR ÇATIŞMASI
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması, mali veya başka türlü, bildirmemektedir.
TEŞEKKÜRLER
Selen Abanuz Eren ve Sevdican Ustun Yilmaz, TÜBİTAK-BİDEB 2244-Üniversite-Sanayi Doktora Programı tarafından desteklenmektedir, proje numarası 118C082.
EK MATERYAL
Ek materyal, yayımlanan makale ile birlikte yayıncının web sitesinde mevcuttur.
REFERANSLAR
[1] Mah JK, Korngut L, Dykeman J, Day L, Pringsheim T, Jette N. Duchenne ve Becker kas distrofisinin epidemiyolojisi üzerine sistemik bir derleme ve meta-analiz. Neuromuscul Disord 2014; 24(6): 482-91. http://dx.doi.org/10.1016/j.nmd.2014.03.008 PMID: 24780148
[2] Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, ve diğerleri. Duchenne kas distrofisinin tanısı ve yönetimi, bölüm 1: Tanı ve farmakolojik ile psikososyal yönetim. Lancet Neurol 2010; 9(1): 77-93. http://dx.doi.org/10.1016/S1474-4422(09)70271-6 PMID: 19945913
[3] Hoffman EP, Brown RH Jr, Kunkel LM. Distrofin: Duchenne kas distrofisi lokusunun protein ürünü. Cell 1987; 51(6): 919-28. http://dx.doi.org/10.1016/0092-8674(87)90579-4 PMID: 3319190
[4] Ervasti JM, Campbell KP. Distrofin-glikoprotein kompleksi'nin lamine ve aktin arasında transmembran bağlayıcı olarak rolü. J Cell Biol 1993; 122(4): 809-23. http://dx.doi.org/10.1083/jcb.122.4.809 PMID: 8349731
[5] Mariol MC, Ségalat L. Distrofin olmadan kas dejenerasyonu kalsiyum bağımlı bir süreçtir. Curr Biol 2001; 11(21): 1691-4. http://dx.doi.org/10.1016/S0960-9822(01)00528-0 PMID: 11696327
[6] Duchenne ve Becker kas distrofisi için moleküler temel: Silme türü ile ciddiyet arasındaki korelasyon. Am J Hum Genet 1989; 45(4): 498-506.
[7] Ervasti JM. Distrofin-glikoprotein kompleksi'nin yapısı ve işlevi. In: Molecular Mechanisms of Muscular Dystrophies. Georgetown: Landes Biosciences 2006; ss. 1-13.
[8] Rando TA. Distrofin-glikoprotein kompleksi, hücresel sinyalizasyon ve kas distrofilerinde hücre hayatta kalımının düzenlenmesi. Muscle Nerve 2001; 24(12): 1575-94.
http://dx.doi.org/10.1002/mus.1192 PMID: 11745966
[9] Petrof BJ, Shrager JB, Stedman HH, Kelly AM, Sweeney HL. Distrofin, kas kasılması sırasında gelişen streslere karşı sarkolemmayı korur. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90(8): 3710-4. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.90.8.3710 PMID: 8475120
[10] Deconinck N, Dan B. Duchenne kas distrofisinin patofizyolojisi: Güncel hipotezler. Pediatr Neurol 2007; 36(1): 1-7.
http://dx.doi.org/10.1016/j.pediatrneurol.2006.09.016 PMID: 17162189
[11] Ramos J, Chamberlain JS. Duchenne kas distrofisi için gen terapisi. Expert Opin Orphan Drugs 2015; 3(11): 1255-66. http://dx.doi.org/10.1517/21678707.2015.1088780 PMID: 26594599
[12] Dumont NA, Wang YX, von Maltzahn J, ve diğerleri. Kas kök hücrelerindeki distrofin ifadesi onların polaritesini ve asimetrik bölünmesini düzenler. Nat Med 2015; 21(12): 1455-63. http://dx.doi.org/10.1038/nm.3990 PMID: 26569381
[13] Counsell JR, Asgarian Z, Meng J, Ferrer V, Vink CA, Howe SJ. Lentiviral vektörler tam uzunlukta distrofin gen terapisi için kullanılabilir. Sci Rep 2017; 7(1): 1-10.
[14] Annoni A, Brown BD, Cantore A, Sergi LS, Naldini L, Roncarolo MG. MikroRNA regüle edilmiş bir transgenin in vivo teslimi, antijen-spesifik düzenleyici T hücrelerini indükler ve immünolojik toleransı teşvik eder. Blood 2009; 114(25): 5152-61. http://dx.doi.org/10.1182/blood-2009-04-214569 PMID: 19794140
[15] Bostick B, Yue Y, Lai Y, ve diğerleri. Adeno-assosie virüs serotip-9 mikrodistrofin gen terapisi, mdx farelerindeki elektrokardiyografik anormallikleri iyileştirir. Hum Gene Ther 2008; 19(8): 851-6. http://dx.doi.org/10.1089/hum.2008.058 PMID: 18666839
[16] Lai Y, Thomas GD, Yue Y, ve diğerleri. Spektrin benzeri tekrarlar 16 ve 17 ile distrofinler, nNOS'u sarkolemmaya bağlar ve kas distrofisi fare modelinde egzersiz performansını artırır. J Clin Invest 2009; 119(3): 624-35. http://dx.doi.org/10.1172/JCI36612 PMID: 19229108
[17] Shin JH, Hakim CH, Zhang K, Duan D. Mdx, mdx3cv ve mdx4cv farelerinin genotipleme yoluyla belirlenmesi için primer rekabet polimeraz zincir reaksiyonu. Muscle Nerve 2011; 43(2): 283-6. http://dx.doi.org/10.1002/mus.21873 PMID: 21254096
[18] Lefaucheur JP, Pastoret C, Sebille A. Yaşlı mdx farelerinde distrofinopatinin fenotipi. Anat Rec 1995; 242(1): 70-6.
[19] Pastoret C, Sebille A. Mdx farelerinde ilerleyici zayıflık ve kas bozulması gösterir. J Neurol Sci 1995; 129(2): 97-105. http://dx.doi.org/10.1016/0022-510X(94)00276-T PMID: 7608742
[20] Lynch GS, Hinkle RT, Chamberlain JS, Brooks SV, Faulkner JA. Mdx farelerindeki hızlı ve yavaş iskelet kaslarının kuvvet ve güç çıkışı, 6-28 aylık. J Physiol 2001; 535(2): 591-600. http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-7793.2001.00591.x PMID: 11533147
[21] Judge LM, Arnett ALH, Banks GB, Chamberlain JS. Dp116 izoformu distrofin, şiddetli distrofik farelerde distrofiyi önlemeden yaşam süresini uzatırken fonksiyonel kas kütlesini korur. Hum Mol Genet 2011; 20(24): 4978-90. http://dx.doi.org/10.1093/hmg/ddr433 PMID: 21949353
[22] Gaedigk R, Law DJ, Fitzgerald-Gustafson KM, ve diğerleri. İnsan retinal distrofin transgenini kullanan mdx/utrn−/− çift mutant farede sağkalımın ve kas fonksiyonunun iyileştirilmesi. Neuromuscul Disord 2006; 16(3): 192-203. http://dx.doi.org/10.1016/j.nmd.2005.12.007 PMID: 16487708
[23] Manning J, O’Malley D. Duchenne kas distrofisi mdx fare modelinin bu hast
alığın anlamamıza katkısı nedir? J Muscle Res Cell Motil 2015; 36(2): 155-67. http://dx.doi.org/10.1007/s10974-015-9406-4 PMID: 25669899
[24] Cros D, Harnden P, Pellissier JF, Serratrice G. Duchenne kas distrofisinde kas hipertrofisi. J Neurol 1989; 236(1): 43-7. http://dx.doi.org/10.1007/BF00314217 PMID: 2915226
[25] Marques MJ, Oggiam DS, Barbin ICC, Ferretti R, Santo Neto H. Mdx farelerinde deflazakort ile uzun süreli tedavi, miyokardiyal fibrozisi azaltır. Muscle Nerve 2009; 40(3): 466-8. http://dx.doi.org/10.1002/mus.21341 PMID: 19623634
[26] Kimura E, Han JJ, Li S, ve diğerleri. Distrofin yerine hücre hattı düzenlenmiş miyogenez: Kas distrofisi tedavisi için yeni bir terapötik yaklaşım. Hum Mol Genet 2008; 17(16): 2507-17. http://dx.doi.org/10.1093/hmg/ddn151 PMID: 18511457
[27] Stewart SA, Dykxhoorn DM, Palliser D, ve diğerleri. Lentivirus ile kararlı gen susturulması RNAi ile primer hücrelerde. RNA 2003; 9(4): 493-501.
http://dx.doi.org/10.1261/rna.2192803 PMID: 12649500
[28] Taştan C, Kançağı DD, Turan RD, ve diğerleri. Relaps/refrakter ALL ve NHL hastalarında CD19 ifade eden B-hücreleri hedef alan CAR-T hücrelerinin Türkiye'deki ilk akademik klinik çalışması için öncesi klinik değerlendirme ve güvenlik analizi. Turk J Haematol 2020; 37(4): 234-47.
http://dx.doi.org/10.4274/tjh.galenos.2020.2020.0070 PMID: 32755128
[29] Zhao Y, Stepto H, Schneider CK. Dünya Sağlık Örgütü lentiviral vektör standardının geliştirilmesi: Lentivirus tabanlı gen terapi ürünlerinin üretim kontrolü ve standartlaştırılmasına doğru. Hum Gene Ther Methods 2017; 28(4): 205-14. http://dx.doi.org/10.1089/hgtb.2017.078 PMID: 28747142
[30] Cornetta K, Yao J, Jasti A, ve diğerleri. Klinik sınıf vektör ürünlerinin replikasyon yetenekli lentivirus analizi. Mol Ther 2011; 19(3): 557-66.
http://dx.doi.org/10.1038/mt.2010.278 PMID: 21179010
[31] Agudo J, Ruzo A, Kitur K, Sachidanandam R, Blander JM, Brown BD. Lentivirüsler için TLR ve TLR dışı medyan yanıtlı bir doğuştan yanıt, hepatosit girişini sınırlar ve farmakolojik blokajla iyileştirilebilir. Mol Ther 2012; 20(12): 2257-67. http://dx.doi.org/10.1038/mt.2012.150 PMID: 22871668
[32] Aartsma-Rus A, van Putten M. Mdx fare modelinde fonksiyonel performansın değerlendirilmesi. J Vis Exp 2014.
[33] Kawano R, Ishizaki M, Maeda Y, Uchida Y, Kimura E, Uchino M. Multiple iskelet kaslarına tam uzunlukta distrofin transdüksiyonu, utrofin/distrofin çift knockout farelerinde motor performansını ve yaşam süresini iyileştirir. Mol Ther 2008; 16(5): 825-31. http://dx.doi.org/10.1038/mt.2008.23 PMID: 18334987
[34] Gibbs EM, Crosbie-Watson RH. Mdx fare modellerinde ambulasyon ölçümü için basit ve düşük maliyetli bir test. J Vis Exp 2017; 130: 56772.
[35] Foster H, Sharp PS, Athanasopoulos T, ve diğerleri. Microdistrofin transgenlerinin kodon ve mRNA dizisi optimizasyonu, distrofik mdx farelerinde AAV2/8 gen transferi sonrası ifadeyi ve fizyolojik sonucu iyileştirir. Mol Ther 2008; 16(11): 1825-32. http://dx.doi.org/10.1038/mt.2008.186 PMID: 18766174
[36] Zatz M, Rapaport D, Vainzof M, ve diğerleri. Duchenne (DMD) ile Becker (BMD) kas distrofisi arasındaki serum kreatin kinaz (CK) ve pirüvat kinaz (PK) aktiviteleri. J Neurol Sci 1991; 102(2): 190-6. http://dx.doi.org/10.1016/0022-510X(91)90068-I PMID: 2072118
[37] Duan D. Duchenne kas distrofisi hastalarında mikro-distrofin gen terapisi sistemik hale geldi. Hum Gene Ther 2018; 29(7): 733-6.
http://dx.doi.org/10.1089/hum.2018.012 PMID: 29463117
[38] Dellorusso C, Crawford RW, Chamberlain JS, Brooks SV. Mdx farelerinde tibialis anterior kasları, kasılma sonucu oluşan yaralanmalara son derece duyarlıdır. J Muscle Res Cell Motil 2001; 22(5): 467-75. http://dx.doi.org/10.1023/A:1014587918367 PMID: 11964072
[39] Chu X, Li J, Qiao C, ve diğerleri. Transgenik mdx farelerinde insan mini-distrofinin uzun vadeli etkisi, kas fizyolojik fonksiyonunu iyileştirir. FASEB J 2021; 35(6): e21628. http://dx.doi.org/10.1096/fj.202100057RR PMID: 33982338
[40] Isaac C, Wright A, Usas A, ve diğerleri. Distrofin ve utrofin "çift knockout" distrofik fareler, dejeneratif muskuloskeletal anormalliklerin bir spektrumunu sergiler. J Orthop Res 2013; 31(3): 343-9. http://dx.doi.org/10.1002/jor.22236 PMID: 23097179
[41] Wang JW, Song M, He YH, Gong HR. Hidrojenin Pd3Ag fazlarında stabilitesi, adsorpsiyonu ve difüzyonu. J Membr Sci 2016; 503: 124-31.
http://dx.doi.org/10.1016/j.memsci.2015.11.021
[42] Long C, Amoasii L, Mireault AA, McAnally JR, Li H, Sanchez-Ortiz E. Postnatal genom düzenleme, distrofik bir fare modelinde distrofin ifadesini kısmen restore eder. Science 2016; 351(6271): 400-3.
[43] Crawford GE, Faulkner JA, Crosbie RH, Campbell KP, Froehner SC, Chamberlain JS. Distrofin ilişkili protein kompleksinin montajı distrofin COOH-terminal alanını gerektirmez. J Cell Biol 2000; 150(6): 1399-410. http://dx.doi.org/10.1083/jcb.150.6.1399 PMID: 10995444